Cell Discov︱纽约大学张泽延等开发谱系追踪捕获技术揭示黑色素瘤维莫非尼耐药的克隆进化机制及脆弱性
责编︱王思珍，方以一
编辑︱杨彬薇
近年来癌症靶向治疗（targeted therapy）取得了巨大的成功，然而，耐药的最终产生导致其往往无法治愈患者。比如，BRAFV600E突变的黑色素瘤患者最初往往对于靶向治疗药物（如Vemurafenib）具有良好的响应，但是耐药最终几乎不可避免的发生限制了患者继续获益。越来越多的研究表明肿瘤内异质性（intra-tumoral heterogeneity）及其克隆进化（clonal evolution）是癌症治疗耐药的重要原因[1,2]。因此，追踪和捕获耐药过程中谱系偶联的克隆进行深入的研究对于理解耐药过程的克隆进化机制以及功能性验证具有重要作用。
2022年10月6日，纽约大学Grossman医学院Erik Sulman教授课题组在Cell Discovery上发表了题为“Lineage-coupled Clonal Capture Identifies Clonal Evolution Mechanisms and Vulnerabilities of BRAFV600EInhibition Resistance in Melanoma”的研究。该研究建立了一种新的基于CRISPR的DNA条形码谱系追踪和捕获技术（命名为CAPTURE），并利用该技术揭示了一些潜在的谱系特异或共享的BRAFV600E突变黑色素瘤对于靶向治疗药物的耐药机制及其克隆进化来源，为克服黑色素瘤维莫非尼耐药提供了新的理论依据，也为靶向治疗耐药的成因和如何克服耐药提供了新的见解和研究手段。
越来越多的证据表明癌症瘤内（intratumor heterogeneity）和其中异质性细胞在治疗期间的克隆进化（clonal evolution）是肿瘤耐药和复发的重要原因[1,2]。然而，目前用于监测克隆进化路径、鉴定耐药机制和耐药克隆脆弱性（vulnerability）的手段在很大程度上仍然有限。为此，该研究开发了一种基于Cas9D10A和成对的gRNA的可靶向的DNA条形码技术，该技术可以利用数千序列可完全设计的高质量gRNA排列组合产生数千万特异的可靶向DNA条形码从而足以标记追踪百万级别的癌细胞谱系（图1）。
图1 一种基于Cas9D10A和成对的gRNA的可靶向的DNA条形码技术策略
（图源：Z-Y Zhang. et al., Cell Discv, 2022）
利用该技术，作者研究了BRAFV600E黑色素瘤对靶向治疗药物维莫非尼耐药的克隆进化和机制（图2）。通过对耐药克隆的追踪和捕获以及多组学整合性研究，作者发现预先存在（pre-existing）和克隆进化后期获得（late-emerging）的基因组或表观的变化都可能参与耐药。其中包括一些已知的重要的耐药机制，这证明本文方法可以有效捕获耐药机制，并且利用本研究技术可进一步发现这些机制的克隆进化来源（比如NRASQ61K是预先存在而不是治疗过程中产生的）以及调控机制（比如进一步发现SOX10耐药过程中的下调表达可能是由于其启动子的DNA甲基化变化）。这些结果证实靶向治疗耐药多样化的进化路径和机制。
图2 捕获耐药克隆的多组学整合分析
（图源：Z-Y Zhang. et al., Cell Discv, 2022）
该研究着重研究了其中一种新的耐药机制染色体18q33（chr 18q33）的扩增（图3），这一突变既存在于预先存在的克隆中也存在于后期克隆进化产生的克隆中。研究发现Chr18q33扩增导致抗凋亡基因BCL2的上调表达从而抑制药物诱导的细胞凋亡，而存在该扩增的克隆相对于其他克隆对于BCL2抑制剂ABT-263更为敏感。临床样品的分析也证明了该机制的临床相关性。这些结果表明BCL2抑制剂或许可以克服或延缓具有chr18q33扩增的BRAFV600E突变黑色素瘤病人的耐药。
图3 Chr18q扩增是一种具有临床相关性的黑色素瘤BRAF抑制剂耐药机制，该机制导致BCL2上调表达和对BCL2抑制剂的敏感性。
（图源：Z-Y Zhang. et al., Cell Discv, 2022）
靶向治疗耐药多样化的进化路径和机制限制了利用逐一针对性策略克服耐药的可行性，因此研究者也探索了这些来自不同克隆进化路径具有不同耐药机制的克隆是否存在“殊途同归”的共同信号通路的改变，这或许可以提供一种新的策略用于更广泛地克服靶向治疗耐药从而使病人获益更多。捕获耐药克隆的转录组分析，发现了一些潜在的共同差异表达基因，进一步富集分析发现了一些共同的信号通路依赖。这其中包括报道过的氧化磷酸化通路和MYC通路，该研究也初步验证了耐药克隆对E2F的依赖性，也提示了其他一些潜在的BRAF抑制剂耐药黑色素瘤共同信号通路依赖性。最后，研究者还展示了CAPTURE一个潜在间接应用（辅助提高单细胞技术对稀有细胞的覆盖），并提供了一种提升灵敏度的CAPTURE升级策略（图4）。
图4 CAPTURE的单细胞应用和可升级性
（图源：Z-Y Zhang. et al., Cell Discv, 2022）
文章结论与讨论，启发与展望
综上所述，该研究建立了一种新的可用于单细胞谱系追踪和捕获的单细胞DNA条形码技术CAPTURE，它基于Cas9D10A和成对的gRNA的可靶向的DNA条形码。近期也有类似的技术已发表或在预印本[3-6]，这说明谱系偶联克隆捕获的重要性。与这些技术相比，CAPTURE的最主要优势是可以利用序列完全设计的gRNA序列而不是利用半随机的序列来获得千万数量级的DNA条形码；而序列完全设计有利于最大化gRNA的效率以及最小化靶向细胞基因组或条形码间的脱靶效应。该技术目前仍未能直接兼容单细胞测序技术，未来进一步开发兼容于单细胞测序的方法将极大提高应用的便利性。该研究提供了一些潜在的新的耐药相关突变还有待进一步深入研究。该研究发现chr18q扩增驱动的BCL2上调表达是一种具有一定临床相关性的黑色素瘤维莫非尼耐药机制而具有该突变的耐药细胞对BCL2抑制剂敏感，进一步研究或许可以使具有chr18q33扩增标记物的BRAFV600E黑色素瘤病人最终获益于BCL2抑制剂。此外，该研究揭示了黑色素瘤对靶向治疗“八仙过海各显神通”般的多样性耐药路径和机制，也探索了多样性耐药克隆潜在的共同的信号通路变化及依赖性，为理解和克服靶向治疗提供了新的见解和思路。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41421-022-00462-7
第一作者兼共同通讯作者：张泽延（左1），通讯作者：Erik Sulman（左6）
（照片提供自：Erik Sulman实验室）
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本文完